Qual é a importância de se trabalhar com cultura pura no laboratório de microbiologia?

Identifica��o bacteriana no laborat�rio de diagn�stico versus taxonomia

O isolamento e a identifica��o de bact�rias de pacientes auxilia o tratamento uma vez que doen�as infecciosas s�o causadas por bact�rias diferentes apresentam uma variedade de cursos e conseq��ncias. Testar a susceptibilidade de isolados cl�nicos a antibi�ticos, ou seja, estabelecer a concentra��o inibit�ria m�nima ou CIM, pode ajudar na sele��o de antibi�ticos para a terapia. O reconhecimento de que certas esp�cies de bact�rias (ou linhagens) est�o sendo isoladas de forma at�pica pode sugerir que tem ocorrido um surto da doen�a, por exemplo, de suprimentos hospitalares contaminados ou por n�o utiliza��o de t�cnicas de assepsia adequadas por parte da equipe hospitalar.

Quando se suspeita de que pacientes estejam com uma infec��o bacteriana, � usual proceder-se ao isolamento de col�nias vis�veis em cultura pura, em placas de meio de cultura s�lido e, ent�o, identificar o microrganismo. A identifica��o � baseada em princ�pios taxon�micos aplicados � situa��o microbiol�gica em curso. No laborat�rio de diagn�stico, muitas amostras devem ser caracterizadas por dia e os resultados obtidos o mais r�pido poss�vel. Os testes devem ser facilmente aprendidos, de baixo custo e poderem ser realizados rapidamente.

Os m�todos cl�ssicos para a identifica��o de bact�rias s�o baseados em caracter�sticas morfol�gicas e bioqu�micas. T�m sido desenvolvidos testes de diagn�stico prov�m informa��es discriminat�rias. H� numerosos testes para cada um dos muitos pat�genos. T�cnicas de biologia molecular (para a caracteriza��o de genes espec�ficos ou segmentos de genes) est�o se tornando comuns nos laborat�rios de diagn�stico.

Abordagens taxon�micas modernas empregam metodologias mais complexas e centram-se no estabelecimento da composi��o estrutural das bact�rias. Isto freq�entemente envolve abordagens baseadas na biologia molecular ou na qu�mica anal�tica. Atualmente se reconhece que muitos esquemas cl�ssicos de distin��o entre bact�rias prov�m pouco conhecimento sobre suas rela��es gen�ticas e, em alguns casos, est�o cientificamente incorretos. Novas informa��es t�m acarretado a altera��o dos nomes de certas esp�cies bacterianas e, em certas situa��es, requereu-se a total reorganiza��o das rela��es dentro e entre muitas fam�lias bacterianas.

Termos taxon�micos (classifica��o) 

Fam�lia: um grupo de g�neros relacionados.

G�nero: um grupo de esp�cies relacionadas.

Esp�cies: um grupo de linhagens relacionadas.

Tipo: um conjunto de linhagens dentro de uma esp�cie (bi�tipo, sorotipo).

Linhagem: um isolado espec�fico dentro de uma esp�cie particular.

O termo mais comumente usado � o nome da esp�cie, por exemplo, Streptococcus pyogenes  - abrevia��o: S. pyogenes. O nome da esp�cie � sempre composto por duas palavras, a primeira define o g�nero, no caso, Streptococcus, e a segunda a esp�cie, neste caso, pyogenes. A primeira letra do nome do g�nero � sempre mai�scula, mas o nome da esp�cie � todo em min�sculas. Ambos os nomes s�o italizados ou grifados.

Passos no isolamento e identifica��o de uma bact�ria

Passo 1: amostras de fluidos org�nicos (por exemplo, sangue, urina, fluido cefalorraquidiano) s�o espalhados em placas contendo meio de cultura s�lido; col�nias isoladas de bact�rias (vis�veis a olho nu) aparecem ap�s a incuba��o das placas por um a v�rios dias (Figura 1). Cada col�nia consiste de milh�es de c�lulas de bact�rias. A observa��o das caracter�sticas dessas col�nias em rela��o a tamanho, forma, textura, cor e (se crescidas em meio agar sangue) rea��es de hem�lise � altamente importante como um primeiro passo na identifica��o bacteriana. Se a bact�ria requer ou n�o oxig�nio para crescer � uma outra importante caracter�stica para a identifica��o.

Passo 2: as col�nias isoladas s�o coradas pelo m�todo de Gram e c�lulas individuais de bact�rias s�o observadas ao microsc�pio.

Passo 3: As bact�rias s�o identificadas usando-se col�nias isoladas. Isto freq�entemente requer outras 24 horas de incuba��o adicional.

A colora��o de Gram

A col�nia � dessecada sobre uma l�mina e tratada como segue (Figuras 2 e 3)

Passo 1: colora��o com cristal violeta

Passo 2: fixa��o com lugol estabiliza a colora��o com o cristal violeta. Todas as bact�rias se coram em azul ou p�rpura.

Passo 3: extra��o com �lcool ou outro solvente. Descora algumas bact�rias (Gram negativas) e n�o outras (Gram positivas).

Passo 4: Colora��o secund�ria com safranina. As bact�rias Gram positivas j� est�o coradas com o cristal violeta e permanecem azuis. As bact�rias Gram negativas se coram em rosa.

Observa-se a apar�ncia das bact�rias sob microsc�pio. Pergunta-se:

• Elas s�o Gram positivas ou negativas

• Qual a sua morfologia (bacilos, cocos, espiraladas, pleom�ficas [formas variadas], etc.)?

• As c�lulas ocorrem de forma isolada, em cadeias ou em pares?

• Qual o tamanho das c�lulas?

Al�m da colora��o de Gram, h� outros m�todos de colora��o menos comumente empregados, por exemplo, a colora��o de esporos ou c�psulas.

Uma outra col�nia obtida a partir daquela primariamente isolada �, ent�o, testada quanto �s suas propriedades bioqu�micas. Por exemplo, a bact�ria fermenta algum a��car, tal como a lactose? Em alguns casos, as bact�rias s�o identificadas (por exemplo, por aglutina��o) com anticorpos dispon�veis comercialmente e que reconhecem ant�genos de superf�cie espec�ficos. Outros testes moleculares comerciais s�o agora amplamente utilizados.

Caracteriza��o Taxon�mica das Bact�rias

H� consider�vel diversidade mesmo dentro de uma esp�cie. Portanto, compara��es entre esp�cies envolvem compara��es de m�ltiplas linhagens de cada esp�cie. Essas compara��es s�o primariamente baseadas em an�lises qu�micas e moleculares.

An�lises qu�micas

Existe uma tecnologia sofisticada para o estudo da composi��o estrutural das bact�rias (mais comumente, a caracteriza��o de �cidos graxos, carboidratos ou ubiquinona). A caracteriza��o de produtos metab�licos secretados, como por exemplo, �lcoois vol�teis e �cidos graxos de cadeia curta, s�o tamb�m empregados.

An�lises moleculares

Seria ideal a compara��o de seq��ncias completas de cromossomos bacterianos, mas isto n�o � poss�vel atualmente. Milh�es de nucleot�dios t�m que ser seq�enciados para cada linhagem. Nos �ltimos anos, conseguiu-se seq�enciar os genomas completos de tipos representativos (ou seja, uma linhagens) de umas poucas esp�cies bacterianas. Em cada caso, isto envolveu uma quantidade enorme de trabalho por grandes grupos de pesquisa dedicados ao seq�enciamento de genomas bacterianos. Alternativamente, as similaridades gen�micas entre grupos bacterianos t�m sido medidas pelos conte�dos de guanina (G) mais citosina (C), usualmente expressa como uma porcentagem (%GC). Isto foi substitu�do por outras duas alternativas: hibridiza��o e seq�enciamento (mais comumente do gene codificando o RNAr 16S).

A homologia DNA-DNA (ou seja, o quanto duas cadeias de DNA de diferentes bact�rias podem se hibridizar) � empregada para comparar o grau de relacionamento gen�tico entre esp�cies ou linhagens de bact�rias. Se os DNAs de duas linhagens bacterianas apresentam alto grau de homologia essas linhagens s�o consideradas como membros da mesma esp�cie. Os DNAs de diferentes esp�cies bacterianas (a menos que sejam estreitamente relacionadas) n�o apresentam homologia.

Nos �ltimos anos, o seq�enciamento de mol�culas de RNA da subunidade riboss�mica 16S (RNAr 16S) tornou-se o "padr�o de ouro" na taxonomia bacteriana. Essa mol�cula tem, aproximadamente, dezesseis mil nucleot�dios de comprimento. A seq��ncia do RNAr 16S prov� uma medida da similaridade gen�mica acima do n�vel de esp�cie permitindo compara��es de relacionamentos gen�ticos por todo o reino bacteriano.

Esp�cies bacterianas estreitamente relacionadas frequentemente t�m seq��ncias RNAr 16S id�nticas. Essa t�cnica, portanto, fornece informa��es complementares � hibridiza��o DNA-DNA. Determina��es de seq��ncias dos genes para o RNAr 16S e de outras regi�es gen�ticas s�o usadas na identifica��o no laborat�rio de microbiologia cl�nica.

Abordagens para diagn�stico r�pido sem cultura pr�via

Certos pat�genos humanos (incluindo os agentes causadores da tuberculose, doen�a de Lyme e s�filis) ou n�o podem ser isolados em laborat�rio ou crescem muito pobremente em cultura. Um isolamento bem sucedido pode ser demorado e em alguns casos at� mesmo imposs�vel. A detec��o direta de bact�rias sem cultivo � poss�vel em alguns casos.

Uma abordagem simples para diagn�stico r�pido - a detec��o de ant�genos bacterianos - � usada em muitos consult�rios m�dicos para a detec��o de Streptococcus do grupo A. Um esfrega�o � feito na garganta do paciente pela t�cnica do Swab e ant�genos estreptoc�cicos extra�dos diretamente da zaragatoa (sem cultura bacteriana pr�via) s�o detectados por aglutina��o de esf�rulas recobertas por anticorpos.

Seq��ncias de DNA bacteriano podem ser amplificadas diretamente de fluidos corporais humanos (pela rea��o em cadeia da polimerase, PCR). Por esta t�cnica, grandes quantidades de genes espec�ficos ou por��es de genes podem ser geradas e rapidamente detectadas. Por exemplo, o diagn�stico r�pido da tuberculose tem sido obtido grandemente bem sucedido.

Finalmente, a observa��o microsc�pica direta de certos esp�cimes cl�nicos pela presen�a de bact�rias pode ser muito �til, como no caso da detec��o de M. tuberculosis em escarro.

A identifica��o sorol�gica de uma resposta a anticorpos do agente infeccioso (presentes no escarro do paciente) s� pode ser bem sucedida v�rias semanas ap�s a ocorr�ncia da infec��o.

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	Esta p�gina foi traduzida do original em ingl�s por Paulo Eduardo Moretti  e � mantida por Richard Hunt

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