Quais as exigências para se controlar a qualidade de alimentos pelos métodos microbiológicos tradicionais?

R. P. Bethe, Campden e Chorleywood Food Research Association

Introdução

A detecção e quantificação de microrganismos nos alimentos ou nas superfícies que entram em contato com eles é parte integrante de qualquer sistema de controle e avaliação de qualidade. Os testes microbiológicos de produtos alimentícios podem ser divididos em dois tipos: a) quantitativos, em que grupos de microrganismos em uma amostra são contados, e o resultado é expresso como o número de organismos presentes por unidade de massa da amostra, eb) qualitativos ("presença / ausência"), que são reduzidos a detectar a presença ou ausência de um microrganismo específico em uma massa de amostra conhecida.

A base dos métodos usados ​​para detectar microrganismos em alimentos é bem conhecida e depende da introdução do alimento em um meio nutriente no qual os microrganismos podem se reproduzir, resultando em seu crescimento visível. Esses métodos são simples, flexíveis, convenientes e geralmente baratos, mas apresentam duas desvantagens: primeiro, os testes são baseados no crescimento de microrganismos no ambiente, o que pode ser demorado e levar a uma longa duração do teste; em segundo lugar, os métodos estão focados na execução manual e, portanto, são trabalhosos.

Nos últimos anos, uma grande quantidade de pesquisa foi realizada no campo de métodos microbiológicos automatizados acelerados (análise expressa). O objetivo desses trabalhos era reduzir a duração dos testes (usando métodos diferentes do cultivo de microrganismos para a detecção e / ou contagem de microrganismos) e reduzir a intensidade do trabalho (através da maior automação possível). Os métodos rápidos automatizados desenvolvidos ganharam alguma aceitação na indústria de alimentos e podem constituir uma ferramenta importante para controlar a qualidade de produtos resfriados. Resultados de testes rápidos podem estender a vida útil de alimentos resfriados em um a dois dias, em comparação com os métodos microbiológicos tradicionais. Além disso, a presença de métodos acelerados de análise microbiológica expressa indica a possibilidade de controle em tempo real e sua aplicação no sistema de avaliação da qualidade segundo o método NAS SR.

 Seleção de amostra

Embora este capítulo discuta os métodos usados ​​para testar alimentos, a questão da amostragem é especialmente importante para o microbiologista. Não importa o quão bom seja um método específico, se a amostra não for coletada corretamente e não for representativa do lote do produto do qual foi retirada, os resultados do teste não têm significado. É útil desenvolver um plano de amostragem no qual os resultados são determinados a partir de uma série de análises, em vez de um único resultado. Atualmente, os microbiologistas geralmente usam planos de amostragem com dois ou três conjuntos de amostras, que indicam o número de amostras de teste individuais de um lote (junto com os limites microbiológicos aplicáveis). Tais planos de amostragem são descritos em detalhes em [2].

Uma vez que um plano de amostragem tenha sido desenvolvido, uma porção representativa do produto deve ser retirada para análise. Para fazer isso, o microbiologista deve compreender o produto e sua microbiologia em detalhes suficientes. Muitos alimentos resfriados não são misturas homogêneas, mas são formados por camadas ou pedaços (um sanduíche pronto é um bom exemplo). Deve ser decidido se o resultado microbiológico é necessário para o sanduíche inteiro (ou seja, pão e recheio), apenas para pão ou apenas para recheio. De fato, em alguns casos, pode ser necessário testar uma parte do recheio misto. Uma vez que a decisão tenha sido tomada, uma amostra pode ser retirada para análise usando uma técnica asséptica apropriada e equipamento de amostragem esterilizado [76]. Uma vez que o procedimento de amostragem tenha sido desenvolvido, o microbiologista pode ter certeza de que as amostras coletadas são amostras representativas do produto sendo testado e que os métodos de verificação podem ser confiáveis.

 Métodos microbiológicos tradicionais

Conforme mostrado na introdução deste capítulo, as técnicas microbiológicas tradicionais são baseadas em um método geralmente aceito: as amostras de alimentos são colocadas em um meio nutriente e mantidas lá por algum tempo para o crescimento de microrganismos. A determinação de microrganismos ou sua contagem é então realizada por avaliação visual de rotina do crescimento da cultura. Esses métodos são tecnicamente simples e relativamente baratos, pois não requerem equipamentos sofisticados. Além disso, eles podem ser facilmente adaptados para determinar o número de microrganismos de vários grupos.

Antes do teste, as amostras de alimentos devem ser liquidificadas para que possam ser misturadas com o meio de crescimento. Isso geralmente é feito da seguinte forma: a amostra é pesada com precisão em um recipiente estéril e um volume conhecido de solvente estéril é adicionado (a proporção da amostra para o solvente é geralmente 1:10); em seguida, a mistura resultante é homogeneizada usando um homogeneizador, que esmaga a amostra e todos os microrganismos entram na solução. A escolha correta do solvente é importante aqui - se os microrganismos na amostra forem afetados negativamente por um valor de pH incorreto ou baixa pressão osmótica, eles podem se danificar ou morrer, o que afetará o resultado final do teste microbiológico. O solvente deve ser bem tamponado a um pH apropriado para o produto a ser testado e equilibrado osmoticamente. Ao testar alguns produtos (por exemplo, os desidratados), que podem conter microrganismos fortemente afetados negativamente antes do início do teste, pode demorar um certo período para sua recuperação, para que as células não morram em sua fase inicial [39].

Métodos quantitativos tradicionais

A contagem do número de microrganismos nas amostras geralmente é feita pelo método da contagem em placas ou pelo método do número mais provável (NMP). O primeiro desses métodos é o mais amplamente usado, e o segundo é geralmente usado apenas para certos microrganismos (por exemplo, Escherichia coli) ou seus grupos (por exemplo, coliformes).

Método de contagem de placas

O método de contagem em placa é baseado na colocação da amostra sobre ou sobre uma camada de ágar em uma placa de Petri. Microorganismos individuais ou pequenos grupos deles ocupam um lugar separado no ágar e, após a incubação, crescem, formando colônias separadas, cujo número é contado visualmente. Diferentes tipos de meio de ágar podem ser usados ​​para contar o número de diferentes tipos de microrganismos. O uso de um meio de cultura não seletivo que é mantido a 30 ° C em condições aeróbicas dará uma contagem microbiana viável total, ou contagem aeróbia mesofílica. Ao alterar as condições de incubação para anaeróbia, uma contagem anaeróbia total é obtida. Mudanças na temperatura levarão a mudanças nos tipos de microrganismos capazes de crescer, demonstrando alguma flexibilidade na abordagem tradicional do ágar. Se houver necessidade de determinar o número de microrganismos de um determinado tipo em uma amostra, para possibilitar o crescimento apenas do tipo de microrganismo necessário, na maioria dos casos é necessário alterar a composição do meio. Existem três abordagens para criar um ambiente para criar ambientes ad-hoc: procedimentos eletivos, seletivos e diferenciais.

Procedimentos eletivos são aqueles em que se incluem reagentes no meio ou se utilizam condições de crescimento que promovem o desenvolvimento dos microrganismos detectados, mas não suprimem o crescimento de outros. Esses reagentes podem ser açúcares, aminoácidos ou outros fatores de crescimento. Os procedimentos seletivos incluem procedimentos para a inclusão de reagentes ou o uso de condições de crescimento que suprimem o desenvolvimento de microrganismos diferentes dos determinados. Deve-se notar que, em muitos casos, fatores seletivos também afetarão negativamente o crescimento dos microrganismos determinados, mas essa influência será menor do que seu efeito em outras células. Exemplos de procedimentos seletivos são a introdução de antibióticos no meio ou o uso de condições de crescimento anaeróbico. Finalmente, os procedimentos diferenciais permitem que os microrganismos sejam distinguidos pelas reações que suas colônias causam no meio. Um exemplo é a introdução de um indicador de pH no meio para distinguir microrganismos produtores de ácido. Na maioria dos casos, o ambiente usará um sistema de abordagem integrado contendo componentes eletivos, seletivos e diferenciais para permitir ao usuário identificar e enumerar o microrganismo que está sendo detectado.

O número de tipos de agar atualmente disponíveis é muito grande para listar. Suas características devem ser encontradas nos guias de referência das empresas que produzem esses meios (por exemplo, Oxoid, LabM, Difco, Merck).

Método MPN

O segundo dos procedimentos de enumeração acima é o método MPN, que estima o número de microrganismos viáveis ​​em uma amostra com base em um método estatístico. A avaliação é obtida preparando diluições de dez vezes de uma amostra e transferindo as amostras resultantes de cada diluição para três (normalmente) tubos de meio de cultura. Os tubos são mantidos e aqueles que apresentam algum crescimento (turbidez) são registrados e comparados com a tabela padrão de resultados [2], que indica o nível de contaminação do produto.

Este método é usado apenas para certos tipos de testes, pois é mais trabalhoso e requer mais materiais do que o método de contagem de placas. Além disso, os limites de confiança são grandes e, portanto, esse método geralmente é menos preciso do que o método de contagem de placas.

Métodos tradicionais de qualidade

Os procedimentos qualitativos são utilizados quando não é necessário saber o número de microrganismos da amostra, mas apenas saber se estão presentes ou ausentes. Normalmente, esses métodos são usados ​​para identificar microorganismos potencialmente patogênicos, como Salmonella, Listeria, Yersinia e Campylobacter. Para realizar a análise, é necessário homogeneizar uma amostra pesada com precisão (geralmente 25 g) no caldo de nutrientes primários e incubar por um tempo especificado em uma temperatura especificada. Em alguns casos, a amostra após o caldo primário pode exigir transferência para o caldo de nutrientes secundários e exposição adicional (incubação). O produto resultante é geralmente aplicado a uma placa de ágar seletiva na qual o crescimento do microrganismo determinado é possível. Um procedimento de cultura demorado é usado porque a amostra pode conter muito poucos microrganismos detectáveis ​​e um grande número de microrganismos de "fundo". Além disso, os microrganismos detectáveis ​​podem ser danificados em alimentos processados ​​e, portanto, os métodos de cultura tornam possível reparar as células danificadas e, em seguida, cultivá-las seletivamente na presença de um grande número de microrganismos concorrentes.

O microrganismo que está sendo detectado na cultura do caldo geralmente é invisível, então o caldo deve ser aplicado a uma placa de ágar seletivo / diferencial. Os microrganismos podem então ser detectados pelo aparecimento de suas colônias. A formação de colônias típicas dos microrganismos em questão no ágar é descrita como colônias putativas. Para confirmar que essas colônias consistem nos microrganismos sendo determinados, determinações bioquímicas e sorológicas adicionais são geralmente realizadas em culturas puras do microrganismo. Isso geralmente requer que as colônias das placas de isolamento primárias sejam transferidas novamente para garantir a pureza. As colônias purificadas são então testadas bioquimicamente, cultivando-as em um meio que mostra se o microorganismo produz certas enzimas ou usa certos açúcares.

Várias empresas agora vendem sistemas de testes bioquímicos em miniatura que permitem aos microbiologistas realizar determinações bioquímicas rápidas ou testes automatizados de maneira rápida e fácil. Os testes sorológicos são realizados em culturas puras de alguns microrganismos isolados (por exemplo, Salmonella) usando anti-soros disponíveis comercialmente.

Métodos expressos e métodos automáticos

O interesse geral em novos métodos microbiológicos é impulsionado em parte pelo aumento da produção de alimentos. Isso leva a:

•  aumentar o volume de amostras armazenadas até que um resultado positivo seja obtido (reduzir o tempo de análise reduziria os custos de armazenamento);
•  aumento do número de amostras analisadas em laboratório (a única forma de processá-las é aumentar o tamanho dos laboratórios e de seu quadro de funcionários, além da utilização de métodos automatizados mais acelerados);
•  uma vida útil mais longa dos produtos refrigerados (uma redução no tempo de análise pode acelerar a produção e, assim, aumentar a vida útil do produto);
•  o uso crescente de procedimentos HACCP (métodos rápidos podem ser usados ​​em procedimentos de controle de qualidade usando o método HACCP).

Existem vários métodos, chamados "métodos expressos", e a maioria deles são muito diferentes uns dos outros e dos procedimentos tradicionais que eles substituem. Esses métodos podem ser divididos em testes quantitativos e qualitativos, o primeiro dando um valor para o número de microrganismos na amostra, enquanto o último indica apenas sua presença ou ausência. Os laboratórios que consideram o uso de métodos rápidos para testes de rotina (de rotina) devem definir cuidadosamente seus requisitos antes de adquirir um determinado sistema de análise rápida. Cada novo método é único e dá um resultado ligeiramente diferente dos outros, tem certas características de tempo, um nível de automação e produtividade. Além disso, alguns métodos não funcionam bem com certos tipos de alimentos ou não podem identificar certos microrganismos ou grupos que precisam ser determinados. Todos esses pontos devem ser levados em consideração antes de se decidir pela inclusão de um determinado método no arsenal do laboratório. Também é importante que o pessoal que usa novos métodos compreenda os princípios que os sustentam, o que significa que, se estiverem claramente errados, poderão descobrir a razão para eles.

Métodos elétricos

A determinação do número de microrganismos em uma solução pode ser alcançada por dois métodos elétricos, um dos quais determina o número e o tamanho das partículas, e o outro controla sua atividade metabólica.

Contagem de partículas

A contagem e o dimensionamento de partículas podem ser realizados em uma base "Coulter" usando um Contador Coulter (Coulter Electrics, Luton, UK). O método é baseado na passagem de uma corrente elétrica entre dois eletrodos colocados nas laterais de um septo com um pequeno orifício. Quando partículas ou células suspensas no eletrólito passam pelo orifício, elas deslocam um volume igual de eletrólito, causando uma queda na condutividade DC que depende do tamanho da célula. Essas mudanças na condutividade são determinadas pelo dispositivo e podem ser convertidas em uma sequência de pulsos de tensão, sendo a amplitude de cada pulso proporcional ao volume da partícula e o número de pulsos correspondente ao número de partículas.

Este método é amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa para experimentos que requerem a determinação do tamanho ou distribuição celular, bem como aplicação em microbiologia clínica, onde a determinação de bactérias é necessária [1]. Em microbiologia de alimentos, entretanto, esse método não tem sido muito usado. Existem relatórios sobre a determinação do número de células no leite [49] e a determinação de levedura na cerveja [83], mas há informações claramente insuficientes em outros estudos. Qualquer aplicação de contagem de partículas em microbiologia de alimentos provavelmente seria limitada a amostras de líquidos não viscosos ou líquidos livres de sólidos em suspensão, uma vez que quantidades muito pequenas de amostra podem causar distorção significativa dos resultados e entupimento do orifício.

Atividade metabólica

O artigo [123] foi o primeiro a relatar o uso de medidas elétricas para controlar o crescimento de microrganismos. O autor usou medidas de condutividade para monitorar a decomposição do sangue e concluiu que as mudanças elétricas eram causadas por íons produzidos pela decomposição bacteriana dos constituintes do sangue. Desde este primeiro relatório, o uso de medições elétricas para controlar o crescimento de microrganismos foi estudado por vários pesquisadores e seu trabalho teve grande sucesso. No entanto, esse método não se espalhou até que instrumentos confiáveis ​​se tornassem disponíveis para monitorar mudanças elétricas em culturas de microrganismos.

Quatro instrumentos estão disponíveis atualmente para detectar microorganismos usando medições elétricas. O Sistema Malthus (IDG, Bary, Reino Unido), baseado em [105], monitora as mudanças de condutividade no meio de cultivo, semelhante ao Sistema Rabit {Don Whitley Scientific, Yorkshire). Dispositivos Bactometer (bioMerieux, Basingstoke, UK) e Batrac (SyLab, Purkersdorf, Austria) [6] podem monitorar tanto a condutividade ativa quanto a capacitância. Todos esses dispositivos têm os mesmos componentes básicos:

a) um sistema de incubação para armazenar amostras a uma temperatura constante durante o teste;

b) uma unidade de controle que mede a condutividade ativa e / ou capacitância de cada célula em intervalos regulares (geralmente a cada 6 minutos);

c) um sistema informatizado de processamento de dados que apresenta os resultados em um formato de fácil utilização.

A determinação do crescimento de microrganismos por meio de sistemas elétricos é baseada na medição das mudanças iônicas que ocorrem no meio ambiente devido ao metabolismo dos microrganismos. As alterações causadas pelo metabolismo dos microrganismos e os processos eletroquímicos usados ​​nesses sistemas são descritos em detalhes na literatura [23, 45, 46]. O princípio é que com o crescimento e o metabolismo das bactérias, a condutividade do meio aumenta. Alterações elétricas causadas por um pequeno número de bactérias não podem ser detectadas com os instrumentos atuais. Para que as alterações sejam registradas, cerca de 1 microrganismos devem estar presentes em 106 ml. Esse valor é conhecido como limite de detecção e o tempo que leva para chegar a esse ponto é chamado de tempo de detecção.

Ao usar sistemas elétricos para determinar o número de microrganismos nos alimentos, a amostra deve primeiro ser homogeneizada. A amostra homogeneizada é colocada na célula ou tubo com o meio de crescimento localizado no dispositivo e a unidade de controle da câmara de incubação ou termostato é conectada a ele. As propriedades elétricas do meio de crescimento são registradas durante o período de incubação. Um recipiente de amostra é geralmente um tubo de ensaio de vidro ou plástico ou célula que contém dois eletrodos. O tubo é preenchido com um meio de crescimento microbiano adequado e uma amostra de alimento homogeneizada é adicionada a ele. As mudanças elétricas que ocorrem no meio de crescimento durante o metabolismo dos microrganismos são monitoradas por meio de eletrodos e registradas pelo dispositivo.

Durante o crescimento e metabolismo dos microrganismos, novas substâncias são formadas no meio ambiente. Normalmente, substratos sem carga ou fracamente carregados são convertidos em produtos finais altamente carregados [44], aumentando a condutividade ativa do meio. O crescimento de alguns microrganismos (por exemplo, levedura) não leva a um aumento significativo da condutividade, o que provavelmente se deve ao fato de esses microrganismos não produzirem metabólitos ionizados, o que pode levar a uma diminuição da condutividade durante o crescimento.

Ao usar um medidor de impedância, a resistência elétrica do meio de crescimento é registrada automaticamente durante o período de incubação em intervalos regulares (por exemplo, após 6 minutos). Quando uma alteração no parâmetro elétrico monitorado é detectada, o tempo decorrido desde o início do teste é calculado pelo computador e geralmente é exibido como o tempo de detecção. A curva completa de mudanças no parâmetro elétrico ao longo do tempo (ver Fig. 8.1) é semelhante à curva de crescimento bacteriano, que tem uma forma sigmoidal com três seções:

a) área inativa, onde todas as mudanças elétricas estão abaixo do limite de detecção do dispositivo;

b) uma região ativa onde ocorrem mudanças elétricas rápidas e

c) uma região estacionária ou de declínio, localizada imediatamente após a região ativa e indicando uma desaceleração nas mudanças elétricas.

A curva de resposta elétrica não deve ser considerada semelhante à curva de crescimento dos microrganismos. Acredita-se [45] que a fase de latência e a fase logarítmica do crescimento de microrganismos recaem nas regiões inativas e ativas da curva de resposta elétrica, até e além do limiar de detecção do dispositivo. As fases logarítmica e estacionária do crescimento bacteriano correspondem à região ativa e à região de decaimento das curvas de resposta elétrica.

Ao usar dados de tempo de detecção de dispositivos elétricos, uma calibração deve ser realizada para avaliar a qualidade microbiológica de uma amostra do produto. A calibração consiste em testar amostras com um teste de placa tradicional e um teste elétrico. Os resultados são apresentados graficamente, com o resultado tradicional no eixo y e o tempo de detecção no eixo x (consulte a Figura 8.2). O resultado é uma curva negativa com

Figura: 8.1 Curva de condutividade ativa obtida quando as bactérias crescem em um ambiente favorável

Figura: 8.2. Curva de calibração mostrando mudanças no tempo de detecção de condutividade e microrganismos viáveis ​​totais

dados cobrindo 4-5 ciclos logarítmicos de microrganismos com um coeficiente de correlação de mais de 0,85 [45]. As calibrações devem ser realizadas para cada tipo de amostra testada usando métodos elétricos; diferentes amostras conterão diferentes tipos de microflora com diferentes taxas de crescimento. Se a calibração estiver incorreta, ela pode afetar significativamente o tempo de detecção e levar a resultados incorretos.

Até agora, consideramos o uso de dispositivos elétricos para estimar a abundância total de microrganismos. Esses sistemas, no entanto, baseiam-se no uso de um meio de cultivo e, portanto, permitem, usando meios especialmente selecionados, o desenvolvimento de métodos de estimativa da abundância ou detecção de determinados microrganismos ou seus grupos. Há bastante trabalho dedicado a medições elétricas para detectar / quantificar microorganismos específicos. Assim, Enterobacteriaceae são dedicados a trabalhos [34,95, 7], Pseudomonas - [132], Yersinia enterocolitica - [31], levedura - [42], E. coli - [24] e Campylobacter - [XNUMX].

No futuro, o número de espécies de microrganismos identificadas aumentará sem dúvida. Uma grande quantidade de pesquisas está em andamento na mídia para a detecção de Listeria, após a qual a mídia para outros microorganismos começará a surgir.

A maioria dos métodos ecléticos descritos acima é baseada no uso de medição por contato, ou seja, as mudanças elétricas são monitoradas por meio de eletrodos imersos no meio de cultivo. Alguns autores [93] apontaram o potencial da condutometria sem contato para a determinação de microrganismos. Nesse caso, o meio de crescimento está localizado em um compartimento da célula e o eletrodo no outro. O líquido ao redor do eletrodo absorve o gás (por exemplo, para o dióxido de carbono, é o hidróxido de potássio). Colocado no meio de crescimento

amostra e o gás é liberado à medida que os microrganismos crescem. Este gás é absorvido pelo líquido ao redor do eletrodo, causando uma mudança detectável na condutividade.

Este método resolve o problema de microrganismos que causam apenas pequenas mudanças na condutividade em células de condutometria de contato convencionais. Tais microrganismos (por exemplo, muitos tipos de levedura) são muito difíceis de detectar pelos métodos tradicionais de condutometria direta, mas ao usar o controle condutométrico sem contato, a determinação torna-se bastante simples [10]. O desenvolvimento de métodos indiretos no futuro poderá melhorar significativamente a capacidade dos sistemas elétricos de detectar microrganismos que causam pequenas alterações elétricas nos sistemas de contato, facilitando a aplicação deste método na indústria de alimentos.

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