Por que bactérias com componentes estruturais diferentes podem ser diferenciadas quando coradas pelo método de Gram?

As bactérias são organismos procariontesagrupados, de acordo com a classificação de cinco reinos, no Reino Monera. Quando analisamos a classificação em três domínios, as bactérias pertencem ao domínio Eubactéria e Archea, sendo esse último composto por bactérias que vivem em ambientes extremos, com alta concentração de sal, ácidos e temperatura.

Principais formas de classificação das bactérias

As bactérias são organismos bastante simples que podem ser agrupados de diferentes formas. Analisando a forma e o arranjo das bactérias, temos as seguintes classificações:

 → Cocos: Bactérias com formato esférico ou oval. Exemplo: Staphylococcus e Streptococcu.

• Diplococos: Duas bactérias em formato de cocos unidas;
• Tétrades: Quatro cocos agrupados;
• Sarcina: Oito cocos unidos formando uma estrutura semelhante a um cubo;
• Estreptococos: Cocos unidos como uma cadeia (veja figura do início deste texto);
• Estafilococos: Cocos agrupados como um cacho de uvas.

 → Bacilos: Bactérias com formato cilíndrico ou em forma de bastão, que pode ser curto ou longo. Exemplo: Escherichia, Bacillus e Clostridium.

• Diplobacilos: Bacilos dispostos aos pares;
• Estreptobacilos: Bacilos unidos formando uma cadeia.

→ Espiraladas: Bactérias com formato espiral. Exemplo: Vibrio cholerae e Leptospira.

• Espirilos: Bactérias em forma de espiral que apresentam corpo rígido e locomovem-se com a ajuda de flagelos;
• Espiroquetas: Bactérias em espiral que são mais flexíveis e locomovem-se por contrações citoplasmáticas;
• Vibriões: Bactérias que apresentam corpo semelhante a uma vírgula.

Existem ainda bactérias que se apresentam como um bacilo extremamente pequeno. Elas são consideradas uma forma de transição entre cocos e bacilos e recebem a denominação de cocobacilo.

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Além da classificação a partir da morfologia das bactérias, esses organismos podem ser classificados ainda em micoplasmas, gram-positivas e gram-negativas. Essa forma de classificação analisa a estrutura da parede celular das bactérias.

Recebem a denominação de micoplasmas aquelas bactérias que não possuem parede celular. As bactérias gram-positivas destacam-se pelas várias camadas de peptidoglicano em sua parede. Já a parede da bactéria gram-negativa é mais complexa e apresenta uma camada mais estreita de peptidoglicano, mas com uma membrana externa de lipopolissacarídeo e outras macromoléculas complexas. 

Coloração de Gram para diferenciar bactérias gram-positivas e gram-negativas

Para identificar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, utiliza-se uma técnica conhecida como coloração de Gram. Nessa técnica, inicialmente, utiliza-se o corante violeta de cristal, submete-se a bactéria a uma solução de iodo, que aumenta a afinidade do corante com a célula, e, posteriormente, utiliza-se um solvente. As bactérias gram-negativas, após serem submetidas ao solventes, descoloram-se, mas isso não ocorre com a gram-positiva. Após descoloração, as bactérias são submetidas à fucsina ou safranina.

As bactérias gram-positivas, ao final do procedimento, ficam coradas de roxo em virtude da atuação do violeta de cristal. As gram-negativas, por sua vez, ficam coradas de vermelho por causa da fucsina. Essa coloração é uma forma importante para diferenciar bactérias e garantir a escolha adequada de um antibiótico em casos de doenças, por exemplo.

Por Ma. Vanessa dos Santos

Carlos Estrela & Jesus Djalma Pécora

Dentre os fatores relacionados que alteram o metabolismo bacteriano estão os fisiológicos ( que englobam a capacidade de síntese, fonte de energia, tensão de oxigênio, temperatura, pH e reprodução) e os bioquímicos (respiração, fermentação, putrefação e outros). Enquanto que entre os componentes enquadrados na virulência estão os fatores de adesão (cápsula, fímbria/fibrila, vesícula); de evasão (cápsula, hidrólise de imunoglobulinas, minetização); de invasão ( flagelo, enzimas-colagenase, hialuronidase, coagulase, neuroaminidase, lecitinase, gelatinase, DNAase, aminas-cadaverina e putrecina, indol, escatol, H2S, ácidos, amônia, ácidos graxos-butirato, propionato e ácido aracdônico) e toxígeno (exotoxina: protéica, imunogênica, neutralizante, toxóide - ação específica e termolábil; endotoxina: lipopolissacarídica, pouco imunogênica, ação inespecífica e termoestábil).

A forma da bactérias pode ser observada através de coloração de Gram que divide as bactérias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, aproximadamente iguais em número e impotância. A reação das bactérias à técnica de Gram expressa diferentes características, de modo especial no que diz respeito à composição química, estrutura, permeabilidade da parede celular, fisiologia, metabolismo e patogenicidade (BURNETT & SCHUSTER, 1982;  NISENGARD & NEWMAN, 1994).

Nas bactérias Gram-negativas, a perede celular está composta por uma camada de peptidioglicano e três outros componentes que a envolvem externamente; lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo.

O peptidioglicano, responsável pela forma das células e proteção do citoplasma frente às diferenças de pressão osmótica entre os meios externo e interno, confere rigidez ao corpo bacteriano. Está formado por dois açúcares aminados, o ácido N-acetil glicosamina e o ácido N-acetil murâmico, e por um tetrapeptídio, sempre ligado ao resíduo de ácido N-acetil murâmico; as sub-unidades peptídeas de cadeias glicídicas adjacentes, são unidas entre si por ligações diretas ou indiretas (pontes de ligação). O peptidioglicano situa-se no espaço periplásmico, localizado entre a membrana citoplasmática (interna) e a membrana externa, onde também são encontradas enzimas hidrolíticas (fosfatases, nucleases, proteases e outras), que facilitam a nutrição bacteriana, proteínas de ligação, que participam da captação de açúcares e aminoácidos a partir do meio, enzimas que inativam certos antibióticos (BURNETT & SCHUSTER, 1982; NISENGARD & NEWMAN, 1994).

A lipoproteína está ligada de modo covalente ao peptidioglicano e não covalente à membrana externa; sua função, inferida de estudos realizados com amostras mutantes, é estabilizar a membrana externa e ancorá-la à camada de peptídioglicano. A membrana externa é uma dupla camada, contendo fosfolipídeos e proteínas e apresentando, em sua camada externa, o lipopolissacarídeo.

Entre suas funções, a membrana externa representa uma barreira molecular, prevenindo ou dificultando a perda de proteínas periplasmáticas e o acesso de enzimas hidrolíticas e certos antibióticos ao peptidioglicano; possui receptores para bacteriófagos e bacteriocinas e participa da nutrição bacteriana. O lipopolissacarídeo consiste no lipídio A (endotoxina), àqual estão ligadas duas regiões de natureza polissacarídica, respectivamente, o �core� e as cadeias laterais. O lipídeo A é um glicofosfolipídeo cujo papel biológico consiste na  participação nos mecanismos de patogenicidade da célula bacteriana (BURNETT & SCHUSTER, 1982; NISENGARD & NEWMAN, 1994).

Entretanto, a parede celular das bactérias Gram-positiva e Gram-negativa são diferentes. A parede celular da bactéria Gram-positiva é espessa, 10 a 50 ?m, chegando até a 80 ?m e a da Gram-negativa é menos espessa, 7,5 a 10 ?m. A membrana citoplasmática adere fortemente ao componente interno da célula bacteriana. A parede celular da bactéria Gram-positiva é única e consiste de uma camada espessa, composta quase que completamente por peptídioglicano, responsável pela manutenção da célula e sua rigidez. As múltiplas camadas de peptidioglicano (15 a 50 ?m) das bactérias Gram-positivas constituem uma estrutura extremamente forte em tensão, enquanto que nas Gram-negativas o peptidioglicano é apenas uma camada espessa e, consequentemente, frágil (SLOTS & TAUBMAN, 1992; NISENGARD & NEWMAN, 1994).

O lipopolissacarídeo (LPS) é o maior fator de virulência, determinando efeitos biológicos que resultam na amplificação das reações inflamatórias. Esta endotoxina é um antígeno fraco não específico que é pobremente neutralizado por anticorpos, sendo capaz de ativar a cascata do complemento. A ativação do complemento envolve a formação de cininas, outro importante mediador da inflamação. Além do mais, ativa plaquetas, mastócitos, basófilos e células endoteliais. O LPS induz os macrofágos a secretarem outras proteínas, as interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8), fator alfa de necrose tumoral (TNF ?), oxigênio reativo, nitrogênio intermediário (óxido nítrico), interferon ?, ? e ?, fatores ativadores de plaquetas e prostaglandinas. Estes são fatores importantes que causam reabsorções ósseas nas lesões periapicais. Mesmo quantidades pequenas de endotoxinas são capazes de induzir a resposta inflamatória periapical. Uma possível explicação para a multiplicidade de achados com endotoxinas é a variabilidade genética do LPS de diferentes microrganismos. As endotoxinas são encontradas em maior quantidade em dentes sintomáticos que naqueles assintomáticos.

Como componente da parede celular das células Gram-positivas está o peptidioglicano, cuja contagem é 40% da massa das células, ligado de modo covalente ao ácido lipoteicoico. Este é composto por polímeros de fosfoglicerol com glicolipídeo no final, sendo potente modificador da resposta biológica. O glicolipídeo e o ácido lipoteicóico se ligam às membranas celulares, particularmente de linfócitos e macrófagos, resultando em ativação celular. São capazes, também, de ativar a cascata do complemento, induzindo a inflamação pulpar e periapical (SCHEIN & SCHILDER, 1975; DAHLÉN & HOFSTAD, 1977; DAHLÉN & BERGENHOLTZ, 1980; FARBER & SELTZER, 1988; SUNDQVIST, 1992; SELTZER & FARBER, 1994).

Como característica específica da célula bacteriana, ao se comparar com a célula humana, observa-se a parede celular que, em conjunto com a membrana citoplasmática, forma o envelope celular das bactérias.

O envelope celular das bactérias Gram-negativas quimicamente consiste de 20 a 25% de fosfolipídeos e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo.

Como sede enzimática, muitas bactérias produzem proteinases que hidrolisam as proteínas uma vez que as bactérias, geralmente, são incapazes de utilizar macromoléculas.

As bactérias, de modo geral, necessitam de condições físico-químicas favoráveis ao seu crescimento e reprodução, e dentre estas encontram-se: temperatura, pH, pressão osmótica, concentrações de substrato, de dióxido de carbono e de oxigênio (BURNETT & SCHUSTER, 1982).

Frente ao conhecimento das estruturas microbianas mais comumente afetadas pelo emprego de uma substância antimicrobiana de uso endodôntico, importa considerar e analisar a dinâmica química, biológica e microbiológica desta substância, cuja preferência atual dado a inúmeras pesquisas, recai no hidróxido de cálcio.

Porque as bactérias Gram

Por que algumas bactérias não se coram pela técnica de Gram?

Qual é o fator diferenciador da coloração de Gram?

É possível identificar todas as espécies bacterianas com o método de Gram?