Embora as bactérias não apresentem reprodução sexuada típica, algumas espécies são dotadas da capacidade promover recombinação genética, capaz de modificar seu genótipo. Essa recombinação consiste, em última análise, na interação de duas moléculas de DNA que são clivadas e religadas entre si, num arranjo diferente do que existia anteriormente. Desse modo, essa mistura de material genético leva à formação de indivíduos com características genéticas diferentes. Os indivíduos, assim modificados, podem se dividir, inúmeras vezes, por cissiparidade (bipartição ou divisão binária), forma assexuada de reprodução [ver PLASMÍDEOS (PLASMÍDEO F), matéria publicada neste blog em 04/06/2013]. A recombinação genética nas bactérias, que está associada à transferência de fragmentos de DNA, pode ocorrer, naturalmente, por três diferentes vias: transformação, transdução e conjugação, que lembram, dentro de certos limites, a reprodução sexuada. A análise desses processos, que se tornou disponível durante a década de 1950, forneceu, em função de serem a base do mapeamento genética, informações valiosas acerca dos genes bacterianos. Em todos esses processos ocorre passagem de material genético de uma bactéria doadora para uma receptora que pode incorporar, por recombinação, o DNA recebido ao seu patrimônio genético. Em consequência, uma bactéria pode passar a revelar uma ou mais características que não possuía antes. Assim sendo, a recombinação, por quaisquer desses mecanismos, mantém, nas bactérias, uma variabilidade genética que compensa a ausência da meiose e da fecundação, levando a que elas tenham maiores chances de se adaptar a ambientes diferentes. A engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante (ver CLONAGEM GÊNICA, matéria publicada neste blog em 26/02/2011) também promove recombinação genética nesses organismos. As mutações (ver MUTAÇÃO GÊNICA, matéria publicada neste blog no dia 15/04/2011) podem, igualmente, contribuir para a diversidade genética de uma população, que é a base do processo evolutivo.
Nesta publicação, veremos apenas a conjugação bacteriana. A transformação e transdução já foram abordadas neste blog em 10/03/2014 e 03/05/2014, respectivamente.
A conjugação bacteriana, descoberta por Joshua Lederberg e Tatum Edward, nos Estados Unidos, em 1946 é o processo de transferência direta e horizontal de genes, através de uma ponte citoplasmática temporária (ponte de conjugação), Essa ponte, formada pelas fímbrias de uma bactéria doadora (“macho”) para uma receptora (“fêmea”), possibilita a troca de material genético entre elas. Graças a essa descoberta, utilizando Escherichia coli, Lederberg e Tatum receberam o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1958. A conjugação bacteriana foi de grande utilidade para o progresso da genética de microrganismos e da genética de modo geral, bem como da biologia molecular e, mais recentemente, da engenharia genética. Graças à descoberta do modo como as bactérias se conjugam, foi possível desenvolver estudos sobre a regulação gênica nos seres vivos e sobre vários outros processos moleculares até então desconhecidos, incluindo o modo de ação dos genes. A ponte de conjugação (figura abaixo), responsável pela conexão direta entre as células conjugantes, decorre de tubos proteicos ocos, denominados pelos sexuais (fímbria sexual ou pilus sexual), que estão presentes apenas nas cepas doadoras. Através desses tubos passa DNA de fita simples da cepa doadora para a receptora, na qual é convertida numa forma de fita dupla que se torna apta a sofrer permuta com regiões homólogas presentes nesta linhagem. As receptoras, por seu turno, desprovidas de fimbrias sexuais, possuem, na sua superfície, macromoléculas, como a proteína superficial OmpA, que facilitam a fixação desses pelos. A descoberta que as bactérias têm “sexos” distintos abriu um novo caminho para os estudos genéticos dos procariontes. A ponte de conjugação, que é relativamente frágil, além de promover o transporte de material genético entre as células conjugantes, também protege o DNA das nucleases ambientais e sua ruptura interrompe a conjugação bacteriana. Dessa forma, esses pares permanecem, via de regra, associados apenas por um curto intervalo de tempo, como veremos adiante.
Como consequência da conjugação, a célula receptora ficará com constituição genética diferente das duas células iniciais, sendo, portanto, um método de recombinação genética, como a transformação bacteriana (matéria publicada neste blog em 10/03/2014) e a transdução bacteriana (matéria publicada neste blog em 03/05/2014 ). Estes dois processos, entretanto, não envolvem, como a conjugação, contato direto entre as células. As novas misturas genéticas serão transmitidas às células filhas através da cissiparidade, como vimos acima. O primeiro passo no processo de conjugação (figura a seguir) consiste na fixação da fímbria sexual da bactéria doadora (dotada de fator F) a receptores específicos presentes na parede da célula receptora. Essa fixação é essencial para estabelecer uma conexão citoplasmática entre as células em conjugação.
Muitos autores consideram a conjugação bacteriana uma forma de reprodução sexuada. Deve-se, entretanto, ser cauteloso com essa terminologia. Embora ela possa promover recombinação, que outros seres conseguem por meio da reprodução sexuada, a conjugação bacteriana não gera novos organismos. Ela é simplesmente a transferência de material genético de uma célula doadora para uma receptora. Dessa forma, ela não pode, literalmente, ser considerada uma reprodução, já que, por definição, reprodução é a formação de novos seres, por meio sexuado ou assexuado.
A conjugação bacteriana depende da presença de um plasmídeo chamado fator F (de Fertilidade) [ver PLASMÍDEOS (PLASMÍDEO F), matéria publicada neste blog em 04/06/2013], dotado de genes que permitem a transferência do DNA de uma célula para outra. Esse plasmídeo, descoberto por Esther Miriam Zimmer Lederberg, é um DNA circular que pode se replicar de forma autônoma na célula, sendo, portanto, um repliconindependente. O fator F apresenta três propriedades importantes: (I) comandar a formação do pelo sexual (figura abaixo), que, como mostramos acima, permite a adesão entre as cepas conjugantes; (II) comandar a síntese de proteínas capazes de bombear DNA para dentro do pelo sexual e (III) poder integrar-se no “cromossomo”, depois de uma recombinação não homóloga, chamada sítio-específica.
As células desprovidas de fator sexual (F–) são chamadas receptoras ou “fêmeas”, enquanto as dotadas desse fator são denominadas doadoras ou “machos”. As doadoras podem ser de três tipos: F+, Hfr e F’ (figura a seguir), sendo as duas últimas, devido às suas propriedades de transferência, as mais importantes. Nas F+ o fator sexual se encontra livre no citoplasma, sendo, portanto, autônomo. Nas Hfr (do inglês high frequency of recombination) ou Afr, o plasmídeo F está integrado ao “cromossomo” bacteriano. Há diferentes tipos de cepas Hfr, caracterizadas pelo local de integração do fator F e pela capacidade de transferir o material genético bacteriano em direções específicas. Dessa forma, existem pares de cepas Hfr que embora o fator sexual seja integrado no mesmo local, transferem o “cromossomo” bacteriano em direções opostas. Em face disto, as linhagens Hfr são bastante utilizadas no mapeamento genético e são importantes no processo evolutivo das bactérias. As F’ (F-linha), por seu turno, resultam da Hfr pela excisão não precisa (“defeituosa”) do fator F, que leva consigo parte do DNA bacteriano adjacente ao local onde estava integrado, sendo, portanto, autônomo dotado de genes “cromossomiais”. Assim sendo, numa conjugação envolvendo F’ sempre ocorre, a exemplo da que envolve Hfr, transferência de genes bacterianos. Lembramos que em havendo uma excisão precisa (correta), o que ocorre normalmente, a cepa Hfr é convertida em F+. Em verdade, numa população que abriga esse fator, estabelece-se um equilíbrio dinâmico entre essas cepas. As linhagens dotadas de fator sexual, integrado ou não, podem realizar a conjugação com as desprovidas do fator F. Durante a conjugação, o plasmídeo F é replicado por um mecanismo denominado “círculo rolante” e apenas uma das fitas é transferida, através da ponte de conjugação, para a cepa receptora, onde a fita complementar é sintetizada, formando um DNA de dupla cadeia, como veremos a seguir na conjugação F+ x F–.
Tipos de conjugação bacteriana
I. F+ x F–
Quando uma bactéria F+ encontra uma F– se estabelece um contato entre elas através da ponte de conjugação (figura abaixo). Em seguida, uma das fitas do fator F, presente na cepa doadora, é clivada por uma endonuclease e uma das extremidades dessa fita começa a migrar para a célula receptora. À medida que o DNA de fita simples vai sendo transferida, a cadeia não clivada que ficou na célula F+ serve de molde para a biossíntese da fita de DNA que esta sendo “perdida”. Por outro lado, à medida que o DNA de cadeia simples entra na célula F–, ela também serve de molde para a biossíntese da fita complementar. Em face da transferência do DNA, por conjugação, demorar apenas alguns minutos e os plasmídeos bacterianos não serem, via de regra, muito grandes, dá tempo de passar uma fita completa do fator F da célula F+ para a célula F–. Após a transferência, o DNA linear de fita dupla, presente na cepa receptora, é fechado e forma um plasmídeo típico, levando a que a bactéria F– se torne F+.
Como consequência dessa conjugação, na qual não há transferência de genes “cromossômicos”, mas apenas do fator sexual (figura a seguir), a bactéria receptora passa a exibir, apenas, características codificadas pelo plasmídeo F, que podem ser transferidas às gerações subsequentes. A cepa F+, por seu turno, mantém todas as suas características genéticas, continuando, inclusive, a ser F+, uma vez que não apresenta perda real de DNA. Deve-se ainda considerar que as células as células F+ podem integrar o plasmídeo F e passar ao estado Hfr, cuja importância veremos a seguir na conjugação Hfr x F–.
II. Hfr x F–
Nesta conjugação, ocorrem duplicação e transferência de parte do “cromossomo” bacteriano (exogenoto) da doadora para a receptora, na qual tem lugar, via de regra, uma recombinação, por “crossing-over”, entre o fragmento transferido do Hfr e o “cromossomo” da F–. Como consequência, é gerada uma célula F– recombinante (figura abaixo), que passa a exibir maior diversidade genética o que implica em maior poder adaptativo. Como mostra a figura, na conjugação entre Hfr e F–, ao contrário do que se verifica na conjugação entre F+ e F–, as bactérias resultantes continuam Hfr e F–.
A manutenção da condição F– se deve ao fato de esta célula não receber uma cópia do plasmídeo F, já que a transferência tem início a partir do “cromossomo” do doador e não a partir do fator sexual. Como a passagem total do genoma leva, em condições ideais, 100 minutos e a ponte de conjugação se mantém por um tempo bem menor, variando de célula para célula, a conjugação costuma ser interrompida precocemente. Como consequência desta precocidade, o fator sexual, que seria o último a passar, não é transferido para a célula receptora, que, dessa forma, continua F–. Em outras palavras, o material genético introduzido na célula F– contém alguns genes cromossômicos, mas não o fator F.
Dependendo do sítio de inserção do fator sexual no “cromossomo” bacteriano e da direção de transferência, diferentes blocos de genes podem passar da cepa doadora para a receptora. A ordem relativa e a distância dos genes, entretanto, não sofrem alterações, permanecendo sempre as mesmas. Assim sendo, numa população em que muitas conjugações Hfr x F– estejam ocorrendo, diferentes tipos de exogenotos podem ser introduzidos nas células F–, o que significa dizer que diferentes tipos de células recombinantes podem surgir. Dessa forma, existe, por exemplo, uma cepa Hfr na qual genes relacionados com a síntese de treonina e leucina são prontamente transferidos por ocasião da conjugação. Em outra, o gene associado com a síntese de metionina está entre os primeiros que entram na célula receptora. A transferência linear de genes (figura a seguir) possibilitou que os cientistas, utilizando a conjugação interrompida, desenvolvessem técnicas para realizar, na década de 1950, os primeiros mapas genéticos de bactérias. A comparação de mapas construídos com diferentes marcas genéticas (genes) e diferentes cepas de E. coli, permitiu concluir que o plasmídeo podia se integrar em pontos diferentes do “cromossomo”, gerando diferentes linhagens Hfr, como vimos acima, e que o “cromossomo” de E. coli era circular (ver TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA, matéria publicada neste blog no dia 10/03/2014).
O mapeamento “cromossômico” bacteriano foi demonstrado pela primeira vez (1955), em E. coli, por Elie Wollman e François Jacob, no Instituto Pasteur (Paris), utilizando a técnica de conjugação interrompida (ver descrição abaixo). A simples agitação do tubo de cultura rompe as pontes de conjugação que unem as células Hfr e F–, interrompendo, consequentemente, a conjugação. Quanto mais longe uma marca estiver da origem de transferência (oriT), mais tempo ela demorará para ser transferida. As que se encontram mais próxima ao oriT, por outro lado, serão as primeiras a serem transferidas. Estabelece-se, dessa forma, um gradiente de transferência. Após a interrupção, em tempos definidos, as células são semeadas em um meio mínimo contendo uma fonte de carbono e um antibiótico, onde apenas as células receptoras são capazes de crescer, como veremos mais adiante em “Trabalhos de Wollman e Jacob (conjugação interrompida)”. O antibiótico atua como “marca”, selecionando as bactérias modificadas (ver PLASMÍDEO, matéria publicada neste blog em 04/06/2013). Os genótipos das colônias resultantes, que são derivadas apenas de células receptoras, são determinados por plaqueamento de réplica em meio adequado. Na conjugação interrompida, apenas aqueles genes que foram transferidos são capazes de se recombinar com o DNA da célula receptora e originar os recombinantes.Determinando o tempo nos quais diferentes genes aparecem nas células receptoras é possível estabelecer as posições relativas dos genes na molécula de DNA bacteriano, o que caracteriza o mapeamento genético. As distâncias dos genes são expressas em minutos, sendo 1 minuto (unidade de medição no mapa genético) a quantidade de DNA que leva 1 minuto para ser transferida. Existem 100 minutos no mapa, pois a transferência da molécula inteira de DNA, em condições ideais, de linhagens de laboratório comum de E.coli, por exemplo, leva cerca de 100 minutos.A transferência da molécula inteira de DNA é pouco provável em face de a ponte de conjugação, que é frágil, ser rompida, naturalmente, antes dos 100 minutos. A interrupção, em verdade, ocorre poucos minutos após iniciada a conjugação, não dando, evidentemente, tempo para que todo o genoma bacteriano seja transferido e muito menos o fator F. Em outras palavras, como vimos acima, o exogenoto presente na célula F–, contém apenas alguns trechos cromossômicos (genes), mas não o fator F. Como a célula aceptora de DNA não recebe uma cópia do plasmídeo, ela não se transforma numa célula F+ e, claro, muito menos numa Hfr. Esse exogenoto pareia com a região cromossômica homóloga, o que permite a ocorrência de recombinação por crossing, processo que introduz variações genéticas na célula receptora. Logo após a recombinação, o exogenoto é degradado, de modo que esta célula volta à sua condição haploide original, já que a conjugação leva à formação de um diploide parcial denominado merozigoto.
O mapeamento por conjugação é uma técnica importante para se determinar as posições relativas dos genes na molécula de DNA de E. coli. Contudo, ele não é inteiramente acurado, visto que os genes que estão distantes menos de 2 minutos não podem ser separados por mapeamento de conjugação. Sabe-se que 2 minutos correspondem a cerca de 92 kb (kilobase) de DNA, espaço suficiente para alguns genes. Além disso, o mapeamento de conjugação é aplicável apenas àquelas espécies de bactérias que possuem plasmídeos F ou seus equivalentes: muitas não os têm. Essas limitações levam a que sejam utilizados, vez por outra, outros métodos de mapeamento genético em bactérias, como a transdução e a transformação. Via de regra, a conjugação interrompida é associada à transdução (ver TRANSDUÇÃO BACTERIANA, matéria publicada neste blog no dia 03/05/2014).
TRABALHOS DE WOLLMAN E JACOB (CONJUGAÇÃO INTERROMPIDA)
O objetivo de Elie Wollman e François Jacob era mostrar, do ponto de vista temporal, como ocorre a transferência de genes bacterianos de uma célula Hfr para uma célula F–. Para isto, eles usaram uma linhagem F– que carregava vários genes mutados e uma cepa Hfr que portava cópias “corretas” (não mutadas) desses genes. A transferência de cada gene do tipo selvagem (não mutado) da célula Hfr para a célula F– seria sinalizada por uma mudança no genótipo da célula receptora. Na conjugação eles utilizaram Hfr strS e F– tre– leu– aziR tonA lac– gal– strR. A marca str [strS (sensibilidade à estreptomicina), presente da cepa Hfr e strR (resistência à estreptomicina), presente na linhagem F–] foi usada para selecionar as cepas receptoras. A tabela abaixo relaciona esses genes (marcadores genéticos) com os respectivos fenótipos.
A experiência foi feita através da mistura, em meio de cultura, de células Hfr e F–, colhendo, em seguida, amostras da cultura em vários intervalos de tempo. Cada amostra foi imediatamente agitada com a finalidade de romper as pontes citoplasmáticas que ligavam as células Hfr e F– interrompendo, portanto, a conjugação. As células foram plaqueadas em um meio de ágar contendo estreptomicina, onde apenas as células receptoras seriam capazes de crescer, como foi enfatizado acima. fr e Os genótipos das colônias resultantes, que são derivadas apenas de células receptoras, foram então determinados por plaqueamento de réplica em meio adequado. Este experimento mostrou que os genes foram passados das células Hfr para a F– em momentos diferentes (tabela abaixo). Após cerca de oito minutos de conjugação, as células receptoras que perderam suas características auxotróficas para treonina e leucina começaram a aparecer, passando à condição de tre+ leu+. Cerca de 10 minutos após o início da conjugação, começou a surgir sensibilidade à azida (aziS) nas células receptoras, que passaram a apresentar o genótipo tre+ leu+ aziS. Por fim, após cerca de 25 minutos, todos genes estudados foram transferido para as células receptoras, que se tornaram tre+ leu+ aziSton+ lac+ gal+, contrastando com condição inicial que era tre– leu– aziR tonA lac– gal– strR.
A explicação dos resultados obtidos por Wollman e Jacob tem por base o fato de que as células Hfr transferem, via de regra, uma porção do DNA hospedeiro como uma molécula linear para as células F–. Se a conjugação for interrompida, apenas aqueles genes que foram transferidos são capazes de se recombinar com o DNA da célula receptora e originar os recombinantes, como já foi mencionado. Mensurando os tempos nos quais os diferentes genes apareciam nas células receptoras, Wollman e Jacob estavam, de fato, mapeando as posições relativas dos genes na molécula de DNA de E. coli. A transferência da molécula inteira de DNA não é muito provável, pois, via de regra, as bactérias, como a E. coli usada no experimento, “abandonam” a conjugação naturalmente antes de serem passados os 100 minutos, que como vimos acima, é o tempo necessário para que todo o genoma seja transferido. Para se mapear o DNA de bacteriano inteiro é necessário, portanto, realizar uma série de experiências de conjugação interrompida, com diferentes linhagens Hfr. As regiões estudadas pelas experiências individuais se sobrepõem, possibilitando que o mapa completo seja construído. Logo, tornou-se aparente que embora os genes sejam transferidos de forma linear, o mapa genético bacteriano é, na verdade, circular.
Cerca de 1500 genes de E. coli foram mapeados, usando essa metodologia. A Tabela a seguir mostra a ordem de transferência dos genes (marcas genéticas) de alguns recombinantes de E. coli, usando 7 diferentes linhagens Hfr, analisados por Elie Wollman e François Jacob. Observando, detalhadamente, a tabela, percebe-se que a ordem relativa dos genes é sempre a mesma. Por exemplo, toda marca Gal tem Ade de um lado e Try do outro. O mesmo se aplica para todas as outras marcas genéticas menos para as que estão em pontas opostas de cada mapa de ligação. O que difere é o ponto de origem e a direção de transferência. Este resultado só é possível de ser explicado em um “cromossomo” circular.
III. F’x F–
Esta conjugação, denominada sexdução ou F-dução, consiste na transferência de material genético de uma célula para outra através de plasmídeos F’. Este plasmídeo, que caracteriza as cepas F’, resulta, como mencionamos acima, de uma excisão incorreta do fator F de uma linhagem Hfr (figura a seguir). Dessa forma, o fator sexual, que estava integrado ao “cromossomo” bacteriano, volta para o citoplasma carregando alguns genes cromossômicos que, daí em diante, serão transmitidos juntos com o plasmídeo F excisado. Embora essa excisão remova genes do “cromossomo” bacteriano, ela não é letal para a bactéria, em face de o segmento removido continuar na célula, integrando o plasmídeo F’.
Nessa conjugação a cepa F– se torna F’, enquanto que F’ continua sendo F’. Ambas ficam, portanto, com uma cópia do plasmídeo F’ (figura abaixo). Além disso, há uma alta frequência de transferência dos genes cromossômicos contidos em F’ e baixa frequência de transferência de outros genes cromossômicos doadores. Ela apresenta, simultaneamente, características da conjugação F+ x F–, no sentido em que promove a transferência de fator sexual e da conjugação Hfr x F–, em face de promover, também, a passagem, do doador para o receptor, de genes presentes no “cromossomo” bacteriano.
Em face de permitir que plasmídeos com genes para a resistência a diversos antibióticos penetrem em uma bactéria, conferindo resistência a esses agentes terapêuticos, a conjugação bacteriana tem grande importância na medicina. Neste contexto, o uso indiscriminado e incorreto de antibióticos tem contribuído para a seleção de plasmídeos com grande número de genes para a referida resistência. Esses plasmídeos podem se encontrar, incialmente, em bactérias inofensivas, que podem transferi-los, por conjugação, para cepas patogênicas, originando as “super-bactérias”, que respondem por grande parte das chamadas infecções hospitalares.